本篇文章給大家談?wù)刪ct116細(xì)胞，以及hct116細(xì)胞培養(yǎng)基配方對(duì)應(yīng)的知識(shí)點(diǎn)，希望對(duì)各位有所幫助，不要忘了收藏本站喔。

HCT116細(xì)胞與CRISPR/Cas9結(jié)合——結(jié)直腸癌治療研究的絕佳拍檔

1. 細(xì)胞背景：

HCT116細(xì)胞是由M·Brattain等人于1979年從一位患結(jié)直腸癌的48歲男性病人中分離得到的。該細(xì)胞在半固體瓊脂糖培養(yǎng)基中形成克隆，在無(wú)胸腺裸鼠中有致瘤性，形成上皮樣的腫瘤，屬于上皮樣貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞系。

2. 應(yīng)用范圍和前景：

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第三，死亡率位居第二，根據(jù) GLOBOCAN 數(shù)據(jù)顯示，2018 年全球結(jié)直腸癌新增 185 萬(wàn)例，約 88 萬(wàn)人死亡，給人類健康帶來(lái)了巨大威脅。[1]因此，研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制以及治療手段對(duì)臨床診斷和治療結(jié)直腸癌具有十分重要的意義。目前，在藥物開發(fā)的最初級(jí)階段即細(xì)胞生物學(xué)水平的鑒定中，HCT166細(xì)胞已成為結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域中被廣泛使用的模式細(xì)胞，具體應(yīng)用舉例如下：

（1）?探究藥物影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的機(jī)制。例如：PPARα在白霉素處理的HCT116細(xì)胞遷移活性及CYP2S1和CYP1B1的表達(dá)中起重要作用[2]

（2）?探究藥物影響結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外作用機(jī)制，如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期改變等。例如：Raddeanin A通過(guò)PI3K/AKT通路調(diào)控人HCT116細(xì)胞凋亡和周期阻滯[3]

（3）?探究藥物對(duì)結(jié)直腸癌治療的敏感性和耐藥性。例如：Doxorubicin抑制HCT116細(xì)胞中miR-140的表達(dá)而上調(diào)PD-L1，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性[4]

（4）?開發(fā)新的癌相關(guān)信號(hào)通路，為臨床治療結(jié)直腸癌提供指導(dǎo)：例如，研究Notch和Wnt信號(hào)通路在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116耐藥中的意義等[5]

（5）?開發(fā)LncRNA和miRNA在結(jié)直腸癌治療中的新途徑。例如：在HCT116細(xì)胞中，YWHAE長(zhǎng)鏈非編碼RNA通過(guò)激活K-Ras/Erk1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路與miR-323a-3p和miR-532-5p競(jìng)爭(zhēng)，為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶位點(diǎn)[6]

如上所述，HCT116細(xì)胞在結(jié)腸癌的各種機(jī)制都具有重要的研究?jī)r(jià)值，而最基本的研究思路一般都從分子層面即基因或蛋白開始，因此CRISPR/Cas9技術(shù)的身影也就理所當(dāng)然地出現(xiàn)在許多研究課題中，畢竟它在研究致癌相關(guān)的單基因功能中有著無(wú)可替代的優(yōu)勢(shì)。

如發(fā)現(xiàn)TRPM4在人結(jié)直腸癌中高表達(dá)，似乎與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和侵襲有關(guān)，通過(guò)在HCT116細(xì)胞中利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)TRPM4基因敲除后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的確都降低了，同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期的改變[7]； 以及Cell報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將野生型KRAS替換為突變型使得雜合突變的HCT116細(xì)胞對(duì)藥物治療更為敏感[8]； 再如利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)HCT116細(xì)胞中的Tks4基因敲除，表現(xiàn)出顯著的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增加，細(xì)胞間的粘附程度降低，發(fā)現(xiàn)Tks4基因在EMT調(diào)控和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]； 發(fā)現(xiàn)CTC1L1142H突變導(dǎo)致端粒酶維持受損，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)HCT116細(xì)胞中的CTC1點(diǎn)突變，證實(shí)了CTC1:STN1相互作用為抑制端粒酶活性所必需[10]。

可以看出，研究人員對(duì)于CRISPR/Cas9技術(shù)的青睞是毋庸置疑的，源井生物提供的CRISPR/Cas9技術(shù)服務(wù)也為眾多科研人員解決了實(shí)驗(yàn)難題，如細(xì)胞基因敲除不徹底、細(xì)胞基因敲入不穩(wěn)定等等，讓更多科研人員能順利實(shí)現(xiàn)他們的科研目標(biāo)。

1. 基因點(diǎn)突變[11]

Hiroyuki Kato等研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)在HCT116細(xì)胞中突變了UTX基因第137和138位氨基酸：G137V和 G137VΔ138，發(fā)現(xiàn)原本表達(dá)于細(xì)胞核的野生型UTX，在兩種突變株的細(xì)胞核中表達(dá)量大大降低了，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增加了，如圖A-C所示：A,B為免疫熒光圖片，C為Western Blot結(jié)果；免疫共沉淀的結(jié)果如圖D所示，這是一種新的UTX調(diào)控機(jī)制，文章中還進(jìn)一步揭示了UTX與MLL3/4復(fù)合物（ASH2L, PTIP and PA1是MLL3/4復(fù)合物的成分）相互作用在癌癥形成中的重要性。

2. 基因敲除[12]

Sara Steinmann等人利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了DAPK1缺失型的HCT116單克隆細(xì)胞系，最終揭示了DAPK1對(duì)結(jié)直腸癌侵襲性的影響。

經(jīng)過(guò)Western Blot驗(yàn)證，Sara Steinmann等人得到了三種DAPK1基因敲除型單克隆細(xì)胞（如圖A所示）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pERK1/2主要位于野生型HCT116細(xì)胞質(zhì)，然而在三種基因敲除型細(xì)胞中，pERK1/2均在細(xì)胞核中顯著表達(dá)。（如圖B所示）

由于絨毛膜尿囊膜模型（CAM）實(shí)驗(yàn)是血管生成的經(jīng)典體內(nèi)模型，研究人員將DAPK1基因敲除型克隆和野生型HCT116細(xì)胞移植到雞CAM上，并在蛋中培養(yǎng)5天，發(fā)現(xiàn)DAPK1的缺失導(dǎo)致CAM體內(nèi)生長(zhǎng)模式的改變和腫瘤出芽的增強(qiáng)(如圖C所示)

此外，該研究團(tuán)隊(duì)利用大鼠腦3D體外模型發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在雞胚胎器官中有更多的擴(kuò)散，并且侵襲能力也增強(qiáng)了。DAPK缺失型HCT116細(xì)胞表現(xiàn)出更多的彌散性腫瘤細(xì)胞，并優(yōu)先在雞胚的肝、心、腦中積累（如圖D所示）。最后，研究人員發(fā)現(xiàn)DAPK1-ERK1信號(hào)通路參與了CRC的轉(zhuǎn)移過(guò)程(如圖E所示)。

3. 基因敲入[13]

Bax是促凋亡Bcl-2基因家族成員之一，在線粒體依賴的凋亡起始中發(fā)揮重要作用，R Peng等研究人員在BAX-KO HCT116細(xì)胞中敲入了5種位于Bax基因上且與Bcl-2其它成員有相互作用的突變位點(diǎn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道BAX-KO HCT116細(xì)胞在一種甾醇類藥物 sulindac的刺激下并不會(huì)發(fā)生凋亡，而R Peng等研究人員發(fā)現(xiàn)在BAX-KO HCT116細(xì)胞中敲入WT BAX能恢復(fù)sulindac和TRAIL引起的HCT116細(xì)胞凋亡；敲入K21E和D33A突變，Bax介導(dǎo)的凋亡被完全恢； 敲入D68R和 S184V突變只恢復(fù)了一部分，而敲入L70A/D71A突變恢復(fù)藥物引起的凋亡程度更低。

該研究是在目的基因敲除了的目的細(xì)胞的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行含有突變位點(diǎn)的目的基因敲入以及WT目的基因敲入（作為對(duì)照），便可清晰地了解目的基因表達(dá)的蛋白和與之相互作用的其它蛋白間相互作用的特定位點(diǎn)關(guān)系，是一個(gè)驗(yàn)證通過(guò)生物信息學(xué)分析得到的預(yù)測(cè)位點(diǎn)是否在蛋白質(zhì)相互作用中真實(shí)起作用的好方法。因此，源井生物也為科研人員提供了相應(yīng)的服務(wù)便利，在享受細(xì)胞基因敲入服務(wù)的同時(shí)，還會(huì)得到我們贈(zèng)送的基因敲除細(xì)胞，滿足科研人員的各種研究需求。

參考文獻(xiàn) :

[1] Bray, Freddie et al. “Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.”?CA: a cancer journal for cliniciansvol. 68,6 (2018): 394-424. doi:10.3322/caac.21492

[2] Khor CY, Khoo BY. PPARα plays an important role in the migration activity, and the expression of CYP2S1 and CYP1B1 in chrysin-treated HCT116 cells.?Biotechnol Lett. 2020;42(8):1581-1595. doi:10.1007/s10529-020-02904-

[3] Meng C, Teng Y, Jiang X. Raddeanin A Induces Apoptosis and Cycle Arrest in Human HCT116 Cells through PI3K/AKT Pathway Regulation In Vitro and In Vivo.?Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:7457105. Published 2019 May 26. doi:10.1155/2019/7457105

[4] Naba NM, Tolay N, Erman B, Sayi Yazgan A. Doxorubicin inhibits miR-140 expression and upregulates PD-L1 expression in HCT116 cells, opposite to its effects on MDA-MB-231 cells.?Turk J Biol. 2020;44(1):15-23. Published 2020 Feb 17. doi:10.3906/biy-1909-12

[5] Kukcinaviciute, Egle et al. “Significance of Notch and Wnt signaling for chemoresistance of colorectal cancer cells HCT116.”?Journal of cellular biochemistry?vol. 119,7 (2018): 5913-5920. doi:10.1002/jcb.26783

[6] Bjeije, Hassan et al. “YWHAE long non-coding RNA competes with miR-323a-3p and miR-532-5p through activating K-Ras/Erk1/2 and PI3K/Akt signaling pathways in HCT116 cells.”?Human molecular genetics?vol. 28,19 (2019): 3219-3231. doi:10.1093/hmg/ddz146

[7] Kappel, Sven et al. “TRPM4 is highly expressed in human colorectal tumor buds and contributes to proliferation, cell cycle, and invasion of colorectal cancer cells.”?Molecular oncology?vol. 13,11 (2019): 2393-2405. doi:10.1002/1878-0261.12566

[8] Szeder, Bálint et al. “Absence of the Tks4 Scaffold Protein Induces Epithelial-Mesenchymal Transition-Like Changes in Human Colon Cancer Cells.”?Cells?vol. 8,11 1343. 29 Oct. 2019, doi:10.3390/cells8111343

[9] Burgess, Michael R et al. “KRAS Allelic Imbalance Enhances Fitness and Modulates MAP Kinase Dependence in Cancer.”?Cell?vol. 168,5 (2017): 817-829.e15. doi:10.1016/j.cell.2017.01.020

[10] Gu, Peili et al. “CTC1-STN1 coordinates G- and C-strand synthesis to regulate telomere length.”?Aging cell?vol. 17,4 (2018): e12783. doi:10.1111/acel.12783

[11] Kato, Hiroyuki et al. “Cancer-derived UTX TPR mutations G137V and D336G impair interaction with MLL3/4 complexes and affect UTX subcellular localization.”?Oncogene?vol. 39,16 (2020): 3322-3335. doi:10.1038/s41388-020-1218-3

[12] Steinmann, Sara et al. “DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells.”?Cell death disease?vol. 10,12 895. 26 Nov. 2019, doi:10.1038/s41419-019-2122-z

[13] Peng, R et al. “Targeting Bax interaction sites reveals that only homo-oligomerization sites are essential for its activation.”?Cell death and differentiation?vol. 20,5 (2013): 744-54. doi:10.1038/cdd.2013.4

如何高效率轉(zhuǎn)染HCT-116人結(jié)直腸癌細(xì)胞？

結(jié)腸癌細(xì)胞很少有轉(zhuǎn)染試劑能轉(zhuǎn)的了，我們?cè)瓉?lái)都是用病毒感染，前段時(shí)間看到西南大學(xué)的一篇文章寫的是Zetalife有，名字Advanced DNA/RNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，我們后面用了轉(zhuǎn)染效率很高，分享給大家。

轉(zhuǎn)染條件

A、HCT-116, SW480, HT-29人結(jié)直腸癌細(xì)胞

B、AURKA質(zhì)粒

C、轉(zhuǎn)染細(xì)胞融合度50%

D、96孔板每孔使用0.5μg質(zhì)粒DNA

6孔每孔使用10 ug質(zhì)粒DNA

(注意：本實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA用量不適用于LIPO3000/2000)

發(fā)表文章部分內(nèi)容

Overexpression of AURKA?Plasmid for AURKA overexpression was obtained from?VectorBuilder. Details about plasmid containing the AURKA gene can?be found at .?html.?colon cancer cells (HCT-116, SW480, HT-29)?were seeded at 50% confluency for 24 h in six-well and 96-well plates. Plasmid (10 ug per-well for six-well and 0.5?μg per-well for?96 plates) and the?Advanced?DNA?RNA?transfection（zeta life,USA) reagent were mixed in equal proportionsand added to the cell culture medium for 6 h. DOX (1?μg/ml) was added?to induce the expression of AURKA. After addition of DOX and PAL for?36 h, cell viability was measured by MTT and apoptosis was detected by。

PAL exerts anti-colon cancer effects by targeting AURKA. (A) PAL promotes apoptosis in colon cancer cells (HCT-116, SW480) in a dose-dependent manner.?(B) PAL promotes G2/M phase arrest in colon cancer cells (HCT-116, SW480) in a dose-dependent manner. (C) The expression of AURKA after DOX treatment for?24 h. (D) Cell density after PAL treatment for 24 h in the cells (HCT-116, SW480) transfected with AURKA overexpression plasmids. DOX is an inducer of AURKA

expression in plasmids. (E) Effect of PAL detected by MTT assay on the proliferation ability of colon cancer cells transfected with AURKA overexpression plasmids. (F)?Effects of PAL detected by.

hct116是什么細(xì)胞

將同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因第10號(hào)染色體轉(zhuǎn)染人類腫瘤細(xì)胞系（HCT116和SW480）,用siRNA作為陰性對(duì)照或者采用非目標(biāo)鎖定對(duì)照