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sds-page電泳時,為什么影響泳動速度的只有一個因素

因為因素都是有條件的，影響泳動速度的有好幾個因素，有的因素作用力大，有的因素作用力小。

因素有:1、 首先決定于帶顆粒的性質(zhì)，即顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，大小及形狀。一般說來，顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快，反之則慢。泳動度還與分子的形狀，介質(zhì)粘度，顆粒所帶電荷有關(guān)，泳動度與顆表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質(zhì)溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍，形成一離子擴(kuò)散層。加以電場時，顆粒向符號相反的電極移動即帶陽電荷顆粒移向負(fù)極，帶陰電荷顆粒移向正移;離子擴(kuò)散層由于帶有過剩的與顆粒符號相反的電荷，可以向相反方向移動。結(jié)果顆粒與離子擴(kuò)散之間的靜電引力使顆粒的泳動度減慢，另外，高分了顆粒表面有一層水，在電場影響下，它與顆粒一起移動，可以認(rèn)為是顆粒的一部分。

2、 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度(每一厘米)支持物體上的電位降，它對泳動度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特，則電場強(qiáng)度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。一般，電場強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動速度越快。根據(jù)電場強(qiáng)度大小，可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳，前者的電壓在100-500伏特，電場強(qiáng)度一般是2-10伏特/厘米;后者電壓可高達(dá)500-1000伏特，電場強(qiáng)度在200-2000伏特/厘米。常壓電泳分離時間需數(shù)小時至數(shù)天，高壓電泳時間短，有時僅幾分鐘即可，高壓電泳主要用于分離氨基酸，肽，核苷酸，由于電壓升高，電壓也隨之增大，故需冷卻裝置。

3、 溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少，對于蛋白質(zhì)，氨基酸等兩性電解質(zhì)而言，溶液pH值離電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶凈電荷越多;電泳速度越快;反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)各不相同，白蛋白等電點(diǎn)是4.0。α2球蛋白等電點(diǎn)是5.06，β球蛋白等電點(diǎn)是5.1，γ球蛋白等電點(diǎn)是7.1。當(dāng)在pH8.6的電泳緩沖液中電泳時，這些蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，它們的泳動速度是白蛋白 α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白。因此，當(dāng)要分離一種蛋白質(zhì)混合物時，應(yīng)選擇一種能擴(kuò)大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值，以利于各種蛋白質(zhì)分子的解離。同時，為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩沖液。

4、 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度是另一個重要選擇的條件，在保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動速度越慢，反之越快。通常緩沖液離子強(qiáng)度選擇在之間。濃度大的緩沖液在合適電壓下，有較低的電阻和較大的電流，產(chǎn)熱較高。如果這種額外的熱可以驅(qū)散，高濃度的緩沖液擴(kuò)散常數(shù)較低，可以產(chǎn)生較窄細(xì)的電泳區(qū)帶。離子強(qiáng)度很高時要用低電壓，避免過多產(chǎn)熱，這樣又導(dǎo)致長的電泳時間，以致增加變性和區(qū)帶分離困難。

5、 電滲作用在支持物的電泳中，影響電泳的另一個重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場中液體對固體支持物的相對移動，例如在pH8.6時，血清蛋白質(zhì)進(jìn)行紙電泳時， γ球蛋白與其他蛋白質(zhì)一樣帶負(fù)電荷，應(yīng)該向正極移動，然而它卻向負(fù)極方向移動，這就是電滲作用的結(jié)果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷，如一束毛細(xì)管，進(jìn)行電泳時蛋白質(zhì)通過這些孔隙向前移動。紙的孔隙帶有負(fù)電荷，與帶電顆粒一樣可以吸引正離子，因此介質(zhì)沿管壁相對地帶的較多的正電荷。在電場中，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)向正極移動，而介質(zhì)卻向反向陰極移動，從而對蛋白質(zhì)顆粒的泳動起阻礙作用。由于γ球蛋白分子顆粒大，凈電荷較少，移動速度慢，電滲作用大于顆粒向前泳動的力，結(jié)果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白質(zhì)，因分子較小，凈電荷較多，電滲作用小于分子向前移動的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白質(zhì)電泳后球蛋白反而在點(diǎn)樣位置之后。

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泳動

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分離膠中離子泳動順序

凝膠的制備：

凝膠由分離膠和濃縮膠組成：上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效應(yīng)，其pH為6.8，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質(zhì)分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應(yīng)，pH為8.8，變性蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷基本一致，泳動速度主要決定于分子量。

制備順序為先灌制分離膠，然后在分離膠上灌制濃縮膠： （四人一組）

1. 在兩塊玻璃板間夾以墊條，用手夾住玻璃板放入電泳槽主體內(nèi)，缺口朝外，再插入斜楔板。

2. 拿一小燒杯，按下表加入各試劑： （12%分離膠） 單體溶液 4ml 分離膠緩沖液（pH8.8） 2.5ml 分離膠緩沖液（pH8.8） 3.3ml 10%SDS 100ul 10%TEMED 30ul 10%過硫酸銨 70ul 3. 上述溶液混勻后，用滴管迅速加入兩玻璃板間，灌注高度為紅色背景下沿線。然后滴上少量水飽和異丁醇，靜置約15分鐘。

4. 待凝膠與異丁醇出現(xiàn)分層時，倒去異丁醇，用洗瓶沖洗凝膠頂部，然后拿一燒杯，按下表加入各試劑： （4%濃縮膠） 單體溶液 0.4ml 濃縮膠緩沖液（pH6.8） 0.38ml 超純水 2.15ml 10%SDS 30ul 10%TEMED 15ul 10%過硫酸銨 30ul 5. 上述溶液混勻后，用滴管迅速加入已制好分離膠的玻璃板間，灌滿后，小心插入梳子，靜置30分鐘。

6. 待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉墊條后，缺口朝內(nèi)放入電泳槽主體，插入斜楔板。 兩組用一個電泳槽主體，兩組玻璃板間即為上槽。

7. 裝好的電泳槽主體放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸電極緩沖液。用滴管沖洗凝膠頂部，并趕走底層的氣泡。

樣品制備：

蛋白質(zhì)樣品需變性并結(jié)合SDS，形成所帶負(fù)電荷相對一致的非折疊衍生物。四人一組，取一1.5離心管，加入30ul鼠IgG樣品和30ul樣品緩沖液，混勻后沸水浴5分鐘，3000rpm離心數(shù)秒，每人取10ul加樣。

電泳：

連接電泳儀，選擇電壓為40伏，藍(lán)色指示劑移動至凝膠底部即停止電泳。取出玻璃板，用保鮮膜包好，置冰箱待明日做蛋白印漬（Western－Blotting